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大学の実験で分からないことがあります。電気泳動図と制限酵素地図を用いて自分が解析したプラスミドがどれなのか判定するというものです。

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農学、バイオテクノロジー | 生物、動物、植物92閲覧xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">250

回答(2件)

制限酵素消化なしのバンドはcccという状態でスーパーコイルした環状DNAです。このバンドが制限酵素消化したすべてのサンプルに残っていることに注意してください。完全消化されていれば見えなくなっているはずのバンドですが、プラスミド精製の過程のアルカリ変性が過剰で(モタモタして時間がかかりすぎたとか)部分変性して制限酵素が認識・消化できなくなったプラスミドが生じたものです。そのバンドは無視しましょう。 E消化では約6 kbの一本のバンドが生じています。 1断片ですから環状プラスミドの一箇所が切断されたもので、約6 kbがDNA全長のサイズです。 (より正確なサイズは、与えられた課題の通りマーカーの移動距離から作成した検量線に従って求めてください)。 同じサイズなのにもかかわらず(-)にあるcccのバンドのほうが見かけ上、サイズが小さいのはcccがコンパクトなスーパーコイルになっているので、 分子の嵩高さが小さくなっているからです。移動度とサイズの関係は線形DNAと同列にあるかうことはできません。 S消化では約4 kbと約2 kbのバンドが生じています。 約6 kbの環状プラスミドを約4 kbと約2 kbに分ける位置にある2点のS認識部位で切れていることを示しています。 (つまり、輪の一方の弧で見て約2 kb、反対側の弧で見て約4 kb離れた2点) E/S消化では約4 kbのS消化断片が約3 kbと約1 kbに分割されています。 これは、S認識部位に挟まれた 4 kbの区間内で、どちらか一方のS認識部位から3 kb、もう一方のS認識部位から3 kbの位置に E認識部位があることを示しています。 さて、この条件に当てはまる選択肢はどれだ?

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lさん 制限酵素で分解したものの電気泳動結果についてですが、 まず E(EcoRIで分解したもの)は断片が一つです。んで、 制限酵素処理をしない ものとの泳動パターンが異なっていますよね。ですから、このプラスミドは EcoRIで全く切れていないのではなく、一か所だけ切れていると判断すべきです。 (ちなみに環状になっているプラスミドはコンパクトに畳まれているので、 一か所が切れてひも状になっているものに比べて見かけが小さくなり 電気泳動での移動度は多少大きくなり、結果分子量がひも状より見かけ上 小さく見えます) 同様に考えると、 S (SalI)では二か所切れて二本の断片になり、 E/S(EcoRI + SalI 両方加えたもの)では三か所切れて三本の断片になっている ということになります。 こう考えると、S の二本の断片の片方に E で切れる場所があって、結果的に 三本の断片になっている、ということになります。 じゃあ S のどちらの長さの断片が E/S の二本の断片になっているか、 それを合わせて候補になっている環状プラスミドの切断部位から どれだけの大きさの断片ができるはずか、と照らし合わせて どれが正しいのか、というパズルを楽しむわけですね。 候補がよく似ているものになっているので、判断がちょっと難しいようです。 こういった電気泳動でのサイズ推定は、0.5kくらいは誤差が出るとして 考えてみてください。頑張って。

ありがとうございます。おかげさまで考え方は大体理解できたように思います しかしどうにも自信がないので考察の確認をお願いしたいです。 4つのサンプルを電気泳動した結果はこの画像の通りになりました。全て左からら-、EcoRl(E)を加えたもの、Sall(S)を加えたもの、E、S両方加えたもので真ん中の電気泳動はマーカーです。

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