往期和大家分享了那些年遇到的细胞分选的坑-样品制备篇(一)，今天和大家分享分选后的流式分析篇。
流式作为一种强大的细胞分析和分选的技术诞生于1965年，迄今已经有55年的历史。一个年过半百的老技术，竟然历久弥新，说明其强大的生命力和不断的技术进步。
流式就是写上一本大部头的著作，也无法面面俱到，这也不是本文的目的。
本文主要说一些和细胞分选之后，细胞纯度分析鉴定的Tips，希望能够帮助到大家。
本人才疏学浅，也并非流式专业出身，如有疏漏在所难免，贻笑大方，就当博君一乐。
流式细胞术，当然离不开流式细胞仪。随着我国能够生产流式细胞仪，价格一下子亲民了许多。几十万到上百万的都可以找到相应的型号。
做为细胞分选后纯度分析的手段，最基本的型号也可以满足基本的需求。如果实验室预算有限，最好先搞清楚流式细胞仪配置，激光和支持的荧光素。
流式和磁分选的前提是一样的，都需要单细胞悬液。在上一期样本制备坑里面，提到有些1)比例极低的细胞最好还是先做一下流式确定比例；2)有些易于凝集的细胞上流式之前，最好过滤一下。
在做流式分析鉴定的时候有哪些常见的坑呢？
1 没有对照，因此没法更加客观的设门。常见的对照有：阴性对照，同型对照。
2 荧光之间的补偿：大部分的荧光素在设备上已经调好了补偿，通常情况下是可以直接调用的。但是当细胞比较特殊的时候，比如补偿都是用外周血调的，而直接来了一个癌症细胞系，整个细胞的大小，表面marker的数量，都完全不同，这个时候最好重新调整一下补偿。
3 和流式老师的沟通：流式很少有自己操作的，基本有专门的老师负责。这个时候和操作的老师沟通清楚实验的设计，所用的荧光素，有哪些对照，有哪些单染管，还是非常有必要的。
4 电压的调整：一个配置不能通吃所有的实验，无需言明。在有些阴阳界限模糊的时候，调高一点电压，阳性更加阳性，而阴性还是阴性，就会得到漂亮的图。
简单调整电压，纯度从26.9%变成98.9%，就是这么神奇！
5 设门：流式虽然发展了50年，但是还是需要人工设门，仍然存在一定的主观性。设门要根据自己的实验，有根据，能自圆其说就行。
6 流式结果的解读：只要对照都设置了，结果是可信的，那就相信结果好了。至于为何与文献不一致，为何与其他人的不一致，自然有其原因，是寻找原因还是质疑结果？That’s a Choice. 比如DC 细胞本身形状不规则，在FSC/SSC上就能展现出来。比如分成两个群，有弱阳强阳，这个也是常有的事情。
7 回收率的计算: 最让人哭笑不得的是根据文献的比例计算理论产量，用实际的结果作为分子，经常说得率太低，真是“窦娥冤/逗鹅冤”，生物样本个体差异极大，同一个体不同时间的差异也极大。建议分选前的样本也染一下，看一下本次实验的比例作为计算分母的依据，然后得率就会正常。每一步的离心操作，都会造成损失，把所有的损失都算到分选的头上，也是有点逗鹅冤。流式分析的时候，拿分选前的样本计数做流式。
