点评 | 高绍荣（同济大学生命科学学院）、杜鹏（北京大学生命科学学院/生命联合中心）
第一次细胞命运决定是小鼠胚胎发育过程中的第一个分化事件，是整个生命体能够正常发育的基础。该过程使得相同的卵裂球逐渐分化形成两种不同类型的细胞谱系：内细胞团 （inner cell mass, ICM）和滋养层细胞（trophectoderm, TE）。ICM会进一步发育为胎儿，而TE进一步发育为胎盘。对于小鼠而言，在自然情况下二者之间很难相互转变。因此，探究ICM与TE谱系间细胞命运转变的关键调控基因对于了解第一次细胞命运决定的分子机制有重要的指导意义。利用ICM在体外建立的胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESCs）和TE在体外建立的滋养层干细胞（trophoblast stem cells, TSCs）均在一定程度上保持了来源细胞的属性，因此常作为研究二者之间相互转变的体外研究平台。而单倍体细胞因其只有一套染色体的优势，常被用于全基因组遗传学筛选研究，尤其是隐性基因功能的探索之中。
2023年12月20日，南开大学帅领团队联合天津医科大学吴旭东团队在Science Advances在线发表题为Haploid-genetic screening of trophectoderm specification identifies Dyrk1a as a repressor of totipotent-like status的研究论文。该研究利用单倍体胚胎干细胞这一理想的遗传学筛选工具，结合PiggyBac转座子体系筛选发现Dyrk1a和Catip的敲除可以实现小鼠ESCs向TSCs的命运转变。通过后续的嵌合实验、荧光报告系统等实验，进一步发现Dyrk1a在调控小鼠ESCs转变为类全能性干细胞这一过程中的重要作用。除此之外，Dyrk1a敲除的小鼠ESCs可以在体外自组装形成囊胚样结构（图1），为研究小鼠第一次细胞命运决定和类全能性干细胞等研究提供了新的思路。
图1: 利用小鼠单倍体ESCs筛选发现调控 ESCs转变为TSCs的关键调控基因
本项研究中，帅领课题组发现Dyrk1a和Catip的缺失可以促进小鼠ESCs转化为诱导的TSCs (iTSCs)，该细胞在细胞分子和发育水平上和野生型TSCs有极大的相似性。此外， Dyrk1a敲除的ESCs在嵌合体实验中，具有贡献到E12.5胎儿、胎盘和卵黄囊的能力，该细胞甚至可以在体外自组装形成囊胚样的结构。结合转录组分析发现，Dyrk1a的敲除可激活一些2-细胞相关的基因，进而诱发类全能性状态，实现ESCs向TSCs的转变。
综上，该团队发现并探究了两个重要的调控因子Dyrk1a和Catip在小鼠ESCs向TSCs命运转变过程中的重要作用，并进一步发现Dyrk1a的敲除可以诱发小鼠胚胎干细胞的类全能性状态，为进一步探究早期胚胎发育过程中的细胞命运决定提供了新的思路。该团队目前仍在对此科学问题进行进一步研究，旨在建立一种更稳定、同质性更好、分化潜能更高的全能性细胞系。
南开大学药物化学生物学国家重点实验室的张文豪博士、博士研究生孙圣怡、博士研究生王晴、徐玫博士和美国西南医学中心李旭博士为本文的共同第一作者。南开大学药物化学生物学国家重点实验室的帅领教授、高倩博士和天津医科大学基础医学院的吴旭东教授为本文的共同通讯作者。
专家点评
高绍荣（同济大学生命科学学院院长）
探究干细胞的分化潜能一直就是该领域的热点和重点。1981年，Martin Evans首次从小鼠的囊胚中成功分离得到了胚胎干细胞（Embryonic stem cells, ESCs），该细胞因其具有分化到三胚层任意类型细胞而备受关注。但是，受来源限制，ESCs并不能分化获得胚外胎盘谱系的细胞，而早期胚胎中的2细胞卵裂球和4细胞卵裂球则有能够发育到胚内和胚外组织的能力，因此这几个时期的细胞具有全能性。因此，是否能够在体外建立具有全能性的干细胞系是该领域的重要挑战。2017 年，邓宏魁团队和刘鹏涛团队分别报道使用不同的化学小分子混合物可以建立扩展型多能干细胞（Extended pluripotent stem cells, EPSCs），该干细胞具有嵌合发育至胚内和胚外组织的能力。但是，这种EPSC与全能性的细胞仍存在较大差距，譬如该干细胞无法贡献到卵黄囊结构。近两年，多个课题组相继报道类似于早期2细胞卵裂球的全能性干细胞的建立，包括杜鹏团队的TBLCs (totipotent blastomere-like cells)，王继长团队的TLSCs (totipotent-like stem cells)，丁胜团队的ciTotiSCs (chemically induced totipotent stem cells)，邓宏魁团队的TPSCs (totipotent potential stem cells) 等，为利用体外细胞培养体系研究着床前胚胎发育过程提供了新的思路。
近日南开大学帅领团队和天津医科大学吴旭东团队合作在Science Advances上发表重要研究成果Haploid-genetic screening of trophectoderm specification identifies Dyrk1a as a repressor of totipotent-like status。该团队基于上述热点问题，利用单倍体ESCs这一遗传学筛选的优势工具细胞，以ESCs向滋养层谱系转变作为切入点，筛选得到调控小鼠ESCs向TSCs转变的关键基因Dyrk1a和Catip。这两个基因被敲除以后，可促进ESCs转变为分子属性和细胞属性都十分接近野生型TSCs的iTSC。有趣的是，该团队在进行嵌合实验的时候，发现Dyrk1a-KO的ESCs不仅能贡献到E12.5的胎儿和胎盘，同时也可以贡献到E12.5的卵黄囊，具备了类似全能性的性质。后续实验表明，Dyrk1a-KO不仅激活了一些全能性基因，还可以促进编辑后的ESCs在体外自组装成为具有ICM、TE和PrE三谱系细胞的囊胚样结构。
此项研究首次使用单倍体ESCs筛选得到调控细胞全能性的关键基因Dyrk1a，并基于此获得了一种类全能性的干细胞，进而为早期胚胎发育相关的基础研究提供了一种新的体外研究体系。
专家点评
杜鹏（北京大学生命科学学院/生命联合中心研究员，国家杰青）
小鼠胚胎发育是从全能性的受精卵开始，经过三次快速卵裂产生8-细胞，进一步压实极化形成桑椹胚，经过第一次细胞命运决定产生两种不同的细胞类型：内细胞团（Inner cell mass, ICM）和滋养外胚层（Trophectoderm, TE），其中ICM在体外培养得到小鼠胚胎干细胞（Embryonic stem cell, ESC），TE在体外培养得到滋养层干细胞（Trophoblast Stem Cell，TSC）。胚胎产生谱系分化意味着从全能性到多能性的转变，发育潜能的降低。对于全能性细胞到ICM和TSC的分化，以及ICM和TSC两个谱系之前的转变，至今并未研究透彻。
南开大学药物化学生物学国家重点实验室帅领课题组近日在Science Advances发表了研究论文Haploid-genetic screening of trophectoderm specification identifies Dyrk1a as a repressor of totipotent-like status，课题组利用小鼠单倍体ESCs（haESCs）这一有助于纯合子基因型研究的遗传工具进行了基因筛选，旨在识别调控ESC到TSC转换的关键基因。研究人员采用强大的基因筛选系统，将单倍体ESCs与piggyBac转座子结合起来，创建基因组规模的突变库。突变型ESCs在滋养层细胞培养基中被诱导形成具有TSC特性的诱导性TSCs（iTSCs）。基因筛选揭示了近12.9万个独立的插入位点涉及超过1万个基因，其中50.38％的插入是在基因区域，成功筛选得到了多个与胚胎第一次细胞命运决定相关的基因，打分较高的两个候选基因Catip和Dyrk1a进行了进一步的验证实验。验证实验产生了Catip和Dyrk1a基因敲除的haESCs细胞系，证明这些基因的缺失不会影响干细胞的多能性。之后焦点转向研究它们在TE转变中的作用。作者证明了Catip-KO和Dyrk1a-KO ESCs在诱导TSC培养基中能够高效转变为具有TSC细胞形态的iTSCs。这些iTSCs表现出高表达的TE特异性标记物，并且可以进一步分化为终端滋养细胞系。
鉴于Dyrk1a在小鼠早期胚胎植入前一直高表达，可能在胚胎发育过程中发挥着重要作用，因此研究团队进一步聚焦于Dyrk1a，发现Dyrk1a-KO ESCs进入一种类似全能的状态，表达部分全能性标记基因，如MuERV-L和Dux。与现在已经报道的体外培养的全能性干细胞（TBLCs (totipotent blastomere-like cells)，TLSCs (totipotent-like stem cells), ciTotiSCs (chemically induced totipotent stem cells）相比，Dyrk1a-KO ESCs整体转录组上更接近TBLCs，与TLSCs和ciTotiSCs距离较远。此外，Dyrk1a-KO ESCs不仅能够嵌合到小鼠胚胎的胚内和胚外组织，还可以在体外自组装为类囊胚结构（Blastoid），突显了它们的全能发育潜力。作者认为，Dyrk1a-KO ESCs倾向于转变成TSC的原因，可能是由于抑制Dyrk1a能够触发从多能性到全能性的过渡，激活了部分全能性基因，使细胞达到类似于全能性的状态，在TSC培养基中就能高效转化为TSC。综上，帅领团队通过单倍体基因筛选方法获得了潜在TE谱系调控基因，不仅揭示了Catip和Dyrk1a在ESC到TSC转换中的关键作用，Dyrk1a在诱导类似全能状态的发现也为理解早期胚胎发育打开了新的研究途径。
原文链接：
http://doi.org/10.1126/sciadv.adi5683
制版人：十一
